根據(jù)下列的免疫細(xì)胞化學(xué)故障排除指南來快速找出問題原因，改善您的實驗步驟和解決方案。首先從下列選項中找到對應(yīng)您免疫細(xì)胞化學(xué)染色問題的圖片:

染色較弱或沒有染色	高背景染色	非特異性染色

一、染色較弱或沒有染色：

細(xì)胞從蓋玻片上脫離: 減少洗滌步驟或輕緩洗滌；用多聚賴氨酸將細(xì)胞黏合到蓋玻片上

細(xì)胞沒有被通透: 甲醇和丙酮固定能使細(xì)胞通透性增強(qiáng)；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透細(xì)胞

細(xì)胞失水變干: 在整個染色過程中樣品必須保持覆蓋于液體中

細(xì)胞固定過度: 減少固定時間

一抗量不夠: 提高抗體濃度；加長孵育時間；

孵育時間太短: 增加一抗和樣品的孵育時間

切片儲存問題: 樣品處理之后應(yīng)該應(yīng)該馬上成像，不然信號會隨時間推移而減弱。如果需要可以將切片于 4?C 黑暗處儲存。

一抗二抗不兼容: 二抗應(yīng)該是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠來源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亞型需要兼容

一抗不適用: 確?？贵w驗證過可以用于ICC；先在免疫印跡中測試抗體, 確?？贵w沒有變質(zhì)

儲存問題: 反復(fù)冷凍/解凍是對抗體不利的，可引起降解. 最好是在收到產(chǎn)品時將其分成多個小份來保存；抗體沒有按照建議的方式保存. 如果是這樣的話可能需要重新購買一支；如果二抗沒有在黑暗處保存 (使用免疫熒光時), 應(yīng)更換一支新的二抗。

蛋白沒有在檢測的組織中出現(xiàn): 做一個陽性對照；如果目標(biāo)蛋白顯現(xiàn)但是信號不強(qiáng), 增加一個擴(kuò)大信號步驟

二、高背景染色

抗體濃度太高: 稀釋一抗/二抗

非特異結(jié)合: 做一個沒有一抗的二抗空白對照.  如果有染色，說明二抗有非特異性結(jié)合，更換一種二抗。

阻斷不夠: 增加阻斷孵育時間或考慮更換阻斷劑。

信號放大過度: 減少信號放大孵育時間，稀釋二抗

洗滌不充分: 步驟之間的適當(dāng)洗滌非常重要. 確保遵循說明說上的洗滌步驟。

三、非特異性染色

抗體濃度過高: 降低抗體的濃度和孵育時間

一抗產(chǎn)自和待測樣本來源同樣的物種 (例. 小鼠抗小鼠): 盡量使用來自不同物種的一抗.  或者阻斷內(nèi)源IgG.  還可以嘗試在孵育時使用1% Triton 來清洗組織.  或用TBS-Tween 20替換 PBS-Tween 20作為洗滌液。

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